1. Introducción
El Cólera es una enfermedad originaria del Asia, se
considera su cuna la región del Delta del Ganges; desde esta zona se difundia por todo el
Asia, Africa, atravesando todo Europa y hasta América (2).
Durante el Siglo XIX terribles pandemias azotaron todas las
regiones de la tierra, principalmente Asia, Africa y Europa, causando gran mortalidad.
En 1817 , se presenta la epidemia en la India que se
extiende en Asia, hasta Pekin y Japón, y por el occidente hasta Astrakan y Costa
Africana, epidemia que persistió durante seis años, produciendo grandes estragos sobre
todo en la India.
En 1826, se reinicia la epidemia, teniendo una mayor
difusión en ciudades como Persia, Moscu, San Petersburgo, Berlin, París y Londres, cruza
el Atlantico y llega a Canadá y a Estados Unidos.
En 1864, aparece una nueva pandemia que duró hasta 1875,
afectando Asia, Africa, Europa y América.
En enero de 1991 aparece en el Perú, afectando casi
simultáneamente a zonas de Chancay, Chimbote, Piura y Callao, difundiéndose
posteriormente en casi todos los departamentos del Perú.
Las hipótesis de la aparición del Cólera en el Perú,
son las descargas de los barcos que contaminaron el mar, peces, mariscos y a través de
portadores sanos, lo cual se vió favorecido por el saneamiento inadecuado, el grado de
desnutrición y pobreza de la población en el Perú.
Es conocido que el hombre es el único reservorio del
Vibrio y el agua es el principal vehículo de transmisión, de tal manera que el riesgo de
contraer la enfermedad es grande, lo que se ve favorecido con el saneamiento inadecuado,
ya que las aguas residuales van al rio (para regar las verduras) y al mar.
Siendo el Cólera un problema de salud pública y el hecho
de haberse propagado rápidamente no solo en el Perú sino en los países vecinos, es de
suma importancia establecer programas de control y vigilancia ambiental.
2. Definición del Vibrio Cholerae
Se presenta en forma de un bastoncito de 1.5 Am a 2.5 Am de
largo y 0.2 - 0.4 Am de ancho, ligeramente encorvado. En ocasiones este encorvamiento es
mínimo apareciendo entonces como verdaderos bacilos. También se les denomina bacilos en
coma.
El Vibrio cholerae es muy móvil, por un flagelo polar, y
es considerado como el más móvil de todas las especies patógenas. Son aerobios o
anaerobios facultativos, gram-negativos, fermentan carbohidratos sin producción de gas,
no producen hidrógeno sulfurado y son oxidasa, manitol, indol, lisina-descarboxilasa
positivos.
Propiedades biológicas
Es un germen relativamente poco resistente a los agentes
exteriores, dependiendo su vida de los factores físicos y químicos que influyen sobre
él y de los factores biológicos que presentan las otras especies microbianas (2).
En las heces con vibriones, después de 24 horas el número
disminuye, sin embargo Greig en la India lo encuentra después de cuatro días en frascos
que conserva en la oscuridad.
Pueden permanecer vivos en la tierra dependiendo del grado
de humedad y del isolamiento directo que reciba del terreno. En el agua vive largo tiempo,
y sólo la existencia de otros microorganismos puede alterar su supervivencia. Se ha
comprobado su existencia en aguas de pozo, río y agua de mar.
3. Método cualitativo
1. Directo
El método consiste en colectar un volúmen determinado de
muestra de agua y enviarla al laboratorio en el menor tiempo posible, luego colocar en un
medio de cultivo alcalino, de igual volúmen que la muestra y de doble concentración, con
pH elevado.
Las muestras son incubadas durante 6 - 8 horas a
temperatura de 35 - 37°C ± 0.5 las colonias típicas de TCBS son sometidas a pruebas
bioquímicas y serológicas. (6)
2. Concentración
Existen varias técnicas para el aislamiento a
identificación de Vibrio cholerae en aguas. Entre los principales métodos de
concentración se tiene: mecha de gasa, método de Moore, tierra de diatomeas y filtro de
membrana. El volúmen de muestra está relacionado directamente con el tipo de muestra.
(Figura 1)
a) Método de Moore (mecha de gasa) modificado
Instalar la mecha en el lugar de muestreo, de tal manera
que permanezca sumergida en el agua durante 48 horas. Después de 48 horas retirar la
mecha con mucho cuidado e introducirla en un frasco estéril con tapa y capacidad de 500
ml conteniendo en su interior 300 ml de agua peptonada alcalina de doble concentración.
Incubar durante 6 a 8 horas a 35 - 37°C ± 0.5.
b) Concentración con tierra de diatomeas
La técnica de concentración para análisis cualitativo es
emplear una capa de tierra de diatomeas, con una almohadilla absorbente de soporte.
Volumenes de muestra son concentrados a través de una capa de tierra de diatomeas. El
concentrado de los organismos adheridos en la tierra de diatomeas y la almohadilla o pad
son colocados asépticamente en un frasco estéril, conteniendo 250 ó 300 ml de agua
peptonada alcalina a doble concentración. Incubar durante 6 a 8 horas a 35 -37°C ± 0.5.
(6)
4. Método cuantitativo
El método de cuantificación empleará mayor tiempo que el
método cualitativo, pero se hace necesario cuando se quiere determinar la densidad de
Vibrio en aguas de recreación, en procesos de tratamiento de aguas servidas, aguas
superficiales, subterráneas y en aguas de consumo humano.
Dependiendo de la calidad del agua, las muestras son
procesadas empleando métodos como NMP, concentración por filtro de membrana y dentro de
este último, el de concentracién por tierra de diatomeas.
A. Método del Número Más Probable
Este método estima la densidad de Vibrio empleando tubos
múltiples (1). Al emplearse este método se hace necesario conocer con anticipación la
densidad probable de Vibrio.
B. Concentración con tierra de diatomeas
La técnica de concentración para análisis cuantitativo
es emplear una capa de tierra de diatomeas, con una almohadilla absorbente de soporte. La
finalidad de este método es utilizar el concentrado de los organismos presentes en la
muestra (6). Esta tierra de diatomeas es colocada encima de la almohadilla o pad, la que
se encuentra sobre la base de la unidad de filtración. De acuerdo al método de
Hammerstrom & Ljutov (1954), y M.I. Yaziz & B.J. Lloyd (1978), volúmenes de
muestra (Ver Cuadro 2) son concentrados a través de una capa de tierra de diatomeas (3,
5, 7). El concentrado de organismos adheridos en la tierra de diatomeas y la almohadilla o
pad son colocados asépticamente en un volúmen de 105.5 ml de medio de enriquecimiento a
concentración simple. Este volúmen es distribuido de la siguiente manera: 1 frasco con
50 ml tubos con 10 ml, 5 tubos con 1 ml y 5 tubos con 0.1 ml (Ver Figuras Nos. 1 y 5).
Aplicación
Este método es el adecuado debido a que concentra las
bacterias presentes de un volumen de muestra conocida. Por este método es posible filtrar
grades volúmenes de muestra sin que llegue a obstruirse (3,5,6).
Cuadro 1
Rango de volumen de muestra de
desecho crudo
y aguas superficiales para Vibrio
Método de Tubos Múltiples
Tipo de muestra
A. Agua superficial
B. Desecho crudo
|
N° tubos y diluciones
empleadas |
| 3
3 3 3
3
3
3 |
| 100- 10 - 1
- 0.1 - 0.01 - 0.001 - 0.0001 |
x
x x x
x
x
x x
x
x |
Cuadro 2
Rango de volumen de muestra de agua
de consumo
humano para cuantificación de Vibrio
Método de Tierra de Diatomeas
| Tipo de muestra |
Volumen Concentrado |
N° tubos
y volumen de muestra empleada |
| 1 |
5 |
5 |
5 |
| 50 ml - |
10 ml |
1 ml |
10 |
C. Agua
potable sin
cloro |
2 - 3 1 |
x |
x |
x |
x |
D.Agua
clorada |
4 - 5 1 |
x |
x |
x |
x |
5. Equipos, material y medios de cultivo
1. Equipos y materiales
Estufa para esterilización en seco
Debe estar equipada con un termómetro y un
termostato y operar normalmente a temperatura de 160 - 180° C, con suficiente capacidad
para permitir la circulación del aire caliente alrededor del material a ser esterilizado.
Autoclave
De tamaño suficiente que permita circular el
vapor alrededor del material a ser esterilizado. Debe estar equipado con una válvula de
seguridad, termómetro. Debe estar equipado con una válvula de seguridad, termómetro
calibrado y colocado en forma tal que se pueda registrar la temperatura mínima del
interior de la cámara y un manómetro o medidor de presión.
La temperatura de esterilización debe ser
alcanzada máximo en 30 minutos, porque algunos ingredientes de los medios de cultivo,
especialmente los que contienen lactosa, no deben ser sometidos al calor durante más de
60 minutos desde que se cierra la tapa del autoclave hasta eu el medio es retirado.
Incubadora de aire caliente
Equipada con un termómetro calibrado con una división de
escala de 0.5°C como requisito mínimo. En la incubadora no debe existir variación
superior a ± 0.5°C, al mismo tiempo se debe mantener la humedad relativa entre 75 y 85%.
Estudios realizados indican que la temperatura ideal para Vibrio cholerae esta entre 35 y
37°C.
La incubadora no debe ser sometida a variaciones existentes
de temperatura causadas por fluctuaciones de la temperatura ambiental, cambios de
corriente eléctrica o apertura innecesaria.
Potenciómetro
Balanzas
Destilador de agua
Frascos para toma de muestras
De vidrio neutro o plástico autolavable no tóxico, con
boca ancha y capacidad suficiente, mínimo un litro.
Placas Petri
Pueden ser de vidrio pyrex, con fondo plano, sin ranuras,
de 15 mm de altura por 100 mm de diámetro. Esterilizadas a 160°C durante dos horas en la
estufa.
Pipetas
Tipo Mohr de 1 ml, 10 ml, graduadas 1/10, con error de
calibración inferior a 2.5%. Pueden ser guardadas en cajas de acero inoxidable, para
facilitar la esterilización. Temperatura de esterilización 160°C durante dos horas en
la estufa.
Vasos de precipitación
Para la preparación de medios de cultivo. Los vasos pueden
ser de vidrio pyrex o de acero inoxidable; libres de cualquier sustancia tóxica.
Tubos de ensayo
De vidrio pyrex o de vidrio neutro de 12 mm x 120 mm, 13 mm
x 100 mm. Esterilizados a 160°C por dos horas en la estufa.
Erlenmeyers
De vidrio pyrex o de vidrio neutro, con capacidad de 250 ml
y 500 ml.
Pinzas
Con punta recta y bordes finos.
Asas de inoculación
De platino o niquel-cromo, colocadas en las asas de Koller.
Estuches para placas Petri y pipetas
De acero inoxidable para facilitar la esterilización.
Frascos paraa agua de dilución
De vidrio pyrex, con tapa de rosca, cierre hermético.
Tijeras
De acero inoxidable con punta fina.
Espátulas
Equipo de filtración
De tres o seis vasos.
Vasos de filtración
De 250 6 500 ml de capacidad, resistente al calor.
Bomba de vacio
2. Medios de cultivo y reactivos
| Agua peptonada alcalina Fórmula
Peptona .............. Cloruro de sodio (NaCl) (NaCl) p.a.
Agua destilada ....... pH final ... 8.6 - 9.0 |
(Difco 0118-01-8)
Concentración |
| 1 X
ó 2 X |
1 X
ó 2 X |
10 gr
20 gr
1000 ml 1000 ml |
10
gr 20 gr 5
gr 10 gr
1000 gr 1000 ml |
|
Preparación
Pesar la peptona y el cloruro de sodio y disolver en 1000
ml de agua destilada fria. Agitar levemente hasta una completa disolución. Ajustar el pH
a 8.6 - 9.0 con una solución normal de Hidróxido de sodio (NaOH - 1N). Distribuir en
volúmenes requeridos. Esterilizar en autoclave, a 121°C, durante 15 minutos.
Solución normal de Hidróxido de Sodio (NaOH - 1N)
Fórmula
Hidróxido de sodio (NaOH) p.a. 40.0 gr
Agua destilada q.s.p.
Preparación
Pesar 40 gramos de hidróxido de sodio y colocar en un
balón volumétrico y completar a un volumen de 1000 ml con agua destilada.
Agas TCBS
Difco 0650 - 01 -1
Fórmula
Extracto de levadura
..................................... 5.0 gr
Peptona.......................................................... 10.0 gr
Citrato de sodio .............................................10.0 gr
Tiosulfato de sodio (Na2S2O3) p.a............. 10.0
gr
Biles de buey deshidratada ....................... 8.0 gr
Sacarosa ..................................................... 20.0 gr
Cloruro de sodio ......................................... 10.0 gr
Citrato férrico ..............................................
1.0 gr
Azul de Bromotil ........................................
0.04 gr
Azul de Timol .............................................
0.04 gr
Agar ............................................................
15.0 gr
Agua destilada estéril ............................... 1000 ml
pH final : 8.6
No autoclavear
Preparación
Pesar 89 gramos del medio deshidratado TCBS, Agar y
disolver con 1000 ml de agua destilada estéril fría. Disolver agitando frecuentemente y
calentando teniendo cuidado de no pasar 92° C. Distribuir en volúmenes de 20 ml
aproximadamente en placas de Petri de 100 mm de diámetro, estériles.
Las placas con el medio podrán ser almacenadas en
refrigeración (2 - 8° C) en oscuro durante tres días.
Agar hierro-tres azúcares (TSI)
Fórmula
Extracto de carne
.................................. 3,0 gr
Extracto de levadura .................................. 3.0 gr
Bacto peptona
.................................. 15.0 gr
Proteosa peptona ..................................
5.0 gr
Dextrosa
................................. 1.0 gr
Lactosa
.................................. 10.0 gr
Sacarosa
................................. 10.0 gr
Sulfato ferroso
................................ 0.2 gr
Cloruro sódico
................................. 5.0 gr
Tiosulfato sódico .................................
0.3 gr
Bacto agar
................................. 12.0 gr
Rojo de fenol
................................. 0.024 gr
Agua destilada
................................ 1 1
Preparación
Disolver 65 gramos de los componentes indicados, en un
litro de agua destilada o desmineralizada y dejar remojar 15 minutos. A continuación se
hierve a vapor fuerte hasta alcanzar su disposición completa. Después de su
distribución en tubos de 120 mm/12 mm, a razón de 3-4 ml, se efectua la esterilización
en autoclave (15 minutos a 121°C). Luego de la esterilización los tubos se colocan en
posición inclinada hasta la solidificación los tuvos se colocan en posición inclinada
hasta la solidificación del medio de cultivo.
El pH listo para el uso es de 7.3 + 0.2. El cultivo puro del germen se siembra en
la superficie inclinada por frotis, y por picadura en la parte columnar. Se incuba a 37°
C por 24 horas.
Agar hierro-lisina (LIA)
Fórmula
Peptona de gelatina
............................... 5.0 gr
Extracto de levadura
............................... 3.0 gr
Dextrosa
.............................. 1.0 gr
L-lisina
..............................10.0 gr
Citrato férrico de amonio
.............................. 0.5 gr
Tiosulfato de sodio
.............................. 0.04 gr
Púrpura de bromo cresol
.............................. 0.02 gr
Agar
................................................................ 13.5 gr
Agua destilada ...................................................
1 1
Preparación
Disolver 33 gramos de los componentes indicados en un litro
de agua destilada. Calentar con agitación frecuente hasta su ebullición. A continuación
se distribuye en tubos de 120 mm/12mm con tapa de rosca, a razón de 3-4 ml. La
esterilización se efectúa en autoclave (15 minutos a 121°C). Luego de la
esterilización los tubos se colocan en posición inclinada hasta la solidificación del
medio de cultivo.
El valor del pH listo para su uso es de 6.7 + 0.2.
El cultivo puro del germen se siembra en la superficie inclinada, por frotis y por
picadura en la parte columnar. Se incuba a 37° C por 24 horas.
Triptona o trípticas (Reacción de indol)
Fórmula
Tiptona o tripticasa
............................................ 10.0 g
Agua destilada
........................................... 1 1
Preparación
Disolver 10 gramos de triptona o tripticasa en un litro de
agua destilada o desmineralizada. Tras su distribución en tubitos de 120 mm/12mm, a
razón de 3-4 ml se esteriliza a 121°C (por 15 minutos).
Reactivo de indol según Kovács
Fórmula
Alcohol isoamilico
.................................. 75 ml
Acido clorhídrico .................................. 25 ml
Paradimetilaminobenzaldehido ............... 5.0 gr
Muchos microorganismos pueden escindir triptófano que
está presente en abundancia, especialmente en la peptona degradada trípticamente, dando
ácido pirúvico, amoniaco e indol. Este último reacciona con el
paradimetilaminobenzaldehido produciendo una coloración rojo oscura. Puesto que el
triptófano da también una reacción coloreada con el paradimetilaminobenzaldehido, es
preciso hacer una separación del indol. Esto se consigue mediante alcohol amílico que
extrae selectivamente el indol.
Preparación
Disolver 5 gramos del paradimetilaminobenzaldehido en 75 ml
de alcohol isoamílico y adicionar 25 ml de ácido clorhídrico. El reactivo debe ser de
color amarillo.
Procedimiento para la prueba de indol
El germen sometido a prueba, cuya pureza de cepa se ha
comprobado previamente, se cultiva durante 12 a 24 horas a 37°C en caldo de triptona.
Luego se adiciona 0.2-0.3 ml del reactivo de Kovacs y se agita. En presencia de indol
libre se presenta al cabo de pocos minutos una coloración rojo cereza en la capa de
reactivo.
Prueba de Indol
Preparación de tiras de indol
Fórmula
p-dimethylaminobenzaldehido .......................
5.0 gr
Methanol ......................................................50.0 gr
0 phosphoric acid ..........................................10 ml
Preparación
Mezclar los componentes. Guardar en frasco oscuro por
tiempo indefinido. Cortar papel filtro en tiras a impregnar con el reactivo, luego secar y
guardar en frascos oscuros por tiempo indefinido.
Prueba de Oxidasa
Fórmula
n - n = dimethil - p - phenylenediamine oxalato
Preparación
Diluir pequeñas porciones del reactivo en agua destilada
estéril ligeramente tibia, mover ligeramente hasta disolver completamente.
Procedimiento
Impregnar papel filtro con la solución color rosado claro,
en el momento de la prueba de oxidación. Con una asa de inoculación retirar una pequena
porción de inóculo del cultivo (agar nutritivo), tocar el papel filtro humedecido con la
solución.
La coloración púrpura es prueba positiva.
Prueba de String-Test
Solución de desoxicolato de sodio a 0.5%
Desoxicolato de sodio
............................................0.5 gr
Agua destilada .......................................................100 ml
Pesar 0.5 fr de desoxicolato y disolver en 100 ml de agua
destilada estéril, guardar en frasco claro.
Procedimiento
En una placa de vidrio colocar una gota del desoxicolate y
agregar una pequeña porción de la colonia. Se formará como un hilo.
Solución de Telurito de Potasio
Solución stock a 0.5%
Fórmula
Telurito de potasio (K2Te03) p.a.
..........................0.5 gr
Agua destilada esteril .............................................100 ml
Preparación
Para 100 ml de agua destilada estéril adicionar 0.5 gr de
telurito de potasio y disolver. Colocar en frasco de vidrio con tapa de rosca.
Colocar 1 ml de la solución de stock de telurito de
potasio al agua peptonada después de esterilizada y enfriada. (4)
Attar Nutritivo modificado
Extracto de carne
.....................................4.0 gr
Peptona ................................................. 10.0gr
Cloruro de sodio ........................................5.0 gr
Agar .....................................................15.0 gr
Agua destilada ......................................1000 ml
pH final luego de esterilización 7.4 - 7.6
Preparación
Pesar los componentes y disolver en un litro de agua
destilada fría, dejar en reposo durante unos 15 minutos. Disolver por calentamiento,
agitando frecuentemente hasta su disolución total, teniendo cuidado de no llegar a
temperatura de ebullición. Distribuir el medio aún estando caliente en volúmenes de 3 a
4 ml en tubos de ensayo de 12 mm x 120 mm. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
Retirar del autoclave y aún estando caliente colocar los tubos en posición inclinada
hasta que el medio se solidifique.
El cultivo puro del germen se siembra en la superficie
inclinada. Se emplea como medio de transporte y cepario de las posibles cepas de Vibrio.
(4)
Agua de dilución
Solucion Stock A
Fosfato monopotásico (KH2p04)
...............................34.0 gr
Agua destilada
.............................................................500 ml
Preparación
Disolver el fosfato monopotásico en 500 ml de agua
destilada, ajustar el pH hasta 7.2 con NaOH 1 N y completar el volumen a un litro con agua
destilada.
Solución Stock B
Sulfato de magnesio (Mg S047H20)
..........................50.0 gr
Agua destilada ...........................................................1000
ml
Preparación
Disolver el sulfato de magnesio en un litro de agua
destilada.
Preparación del agua de dilución
Agregar 1.25 ml de la solución Stock A de fosfato
monopotásico y 5 ml de la solución Stock B de sulfato de magnesio a un litro de agua
destilada.
Distribuir en cantidades que aseguren luego de esterilizar
durante 15 minutos a 121°C un volumen de 90 ± 2 ml.
Antisuero - Poly`- Vibrio cholerae
6. Muestreo
Los puntos de muestreo son ubicados en las posibles vías
de entrada del Vibrio cholerae.
En aguas residuales (aeropuertos, puertos, caletas,
estaciones de tren, etc.).
Deben ser escogidos lugares próximos a hospitales, red
pública, fuentes de aguas superficiales, que reciben aguas residuales domésticas.
Las muestras deben ser debidamente identificadas (número
de muestra, fecha y hora de muestreo, lugar de muestreo, origen de la fuente).
Las muestras se podrán obtener en forma directa,
colectando una porción o volumen de agua o colocando una mecha (Método de Moore)
modificada en el lugar designado y recogerlo despues de 24 6 48 horas.
Para aguas superficiales o aguas residuales se podra
colectar volumenes de 100 6 500 ml.
Para la concentración de las muestras se emplea un equipo
de filtración Millipore y una capa de 1.5 cm de tierra de diatomeas como capa filtrante,
sobre una almohadilla absorbente. (Ver Figura 1) .
Al recolectar la mecha después del tiempo indicado,
colocarla en el lugar, en un frasco de boca ancha, que contiene 300 ml de agua peptonada a
doble concentración. La muestra deberá ser enviada inmediatamente al laboratorio para el
análisis respectivo.
El tiempo recomendado desde la toma de muestra y el inicio
del análisis es de dos a seis horas, siendo el tiempo máximo de almacenamiento 24 horas,
en refrigeración.
En casos que la muestra no pueda ser analizada en un
período de seis horas, se podrá agregar telurito de potasio en concentración 1:200,000
al agua peptonada alcalina.
La finalidad del telurito es inhibir el desarrollo de otras
bacterias que puedan interferir el Vibrio.
7. Procedimiento
Método cualitativo
Para aguas superficiales y aguas residuales se colecta 100
ó 500 ml de muestra y se coloca en medio de cultivo de agua peptonada alcalina de igual
volumen que la muestra y a doble concentración.
Para aguas superficiales y aguas residuales, también se
emplea la mecha de gasa (modificada) y el método de.concentración con tierra de
diatomeas. (Ver Figuras 2 y 3).
La mecha es colocada en agua peptonada alcalina a incubado
durante 6 - 8 horas a temperatura de 35 - 37°C.
El concentrado de los organismos adheridos en la tierra de
diatomeas y la almohadilla o pad son colocados asépticamente en un frasco estéril o
Erlenmeyer conteniendo 250 a 300 ml de agua peptonada alcalina a doble concentración.
Incubar durante 6 a 8 horas a 35 - 37°C. Después de la incubación retirar
cuidadosamente el frasco de la incubadora, evitando agitar.
Del agua peptonada, con una asa de inoculación se colecta
el material de la superficie, y se siembra en placas duplicadas con medio de selección
(TCBS). Las placas con la muestra son incubadas en posición invertida a 35 - 37°C
durante 16 - 24 horas.
Después de la incubación se hace el reconocimiento de las
colonias típicas desarrolladas en las placas. Las colonias típicas son de 1 a 2 mm de
diámetro, amarillas, con halo y ligeramente convexas.
De cada placa de selección se aisla tres colonias típicas
de Vibrio y se transfiere a las pruebas bioquímicas. Para las pruebas bioquímicas se
emplean tubos de 13 x 100 mm y los medios de cultivo empleados son: triple azúcar hierro
agar (TSI), Lisina hierro agar (LIA). La inoculación es por picada en la profundidad y
estriamiento en la superficie. Las tiras de papel filtro, para la prueba y de indol, se
colocan en los tubos de (TSI). Incubar a 35 - 37°C durante 24 horas.
La lectura de las reacciones bioquímicas de estos medios
darán cepas con características de Vibrio, las que pasaran a las pruebas de oxidasa,
string test y luego la prueba serológica. La reacción en los tubos de fermentación con
los medios de TSI y LIA son los siguientes:
TSI ---------> K/A (alcalina/ácido, gas a
hidrógeno sulfurado negativo)
LIA --------- > K/K (alcalino/alcalino, no hay
cambio de color, gas a hidrÓgeno sulfurado negativo)
INDOL -------> Positivo (tirAs de papel
filtro con color grosella)
Las cepas diagnosticadas bioquÍmicamente y
serolÓgicamente como Vibrio son remitidas al Instituto National de Salud, laboratorio de
referencia.
MÉtodo cuantitativo
Para las muestras de aguas superficiales o aguas residuales
proceder según Cuadros Nos. 1 y 2.
Se puede utilizar series de tres o cinco tubos con agues
peptonada, empleando directamente porciones de 100, 10 ml de muestra original; el medio de
enriquecimiento debe estar a doble concentración y porciones de 1 ml y menores de 1 ml,
el medio de enriquecimiento debe estar a concentración simple. (Ver Figures 3)
Pares la preparacidn de diluciones (Ver Figures 4).
- Con una pipeta est6ril transferir 10 ml de la
muestra original a un frasco con 90 ± 2 ml de agua de dilución amortiguada con fosfato.
De esta manera se tiene la primera dilución llamada dilución (A) (10-1) correspondiente
a 10 ml de la muestra original en el frasco de dilución, siendo que 1 ml de la misma
corresponde a 0.1 ml de muestra original.
El cálculo es el siguiente:
Volumen de muestra
= dilución (A)
Volumen de agua de dilución + volumen de muestra
Dilución (A)
10 =
10 = 0.1 ml
90 + 10
100
- Homogenizar el frasco que contiene la dilución (A)
(10-1) de la muestra y con una nueva pipeta esterilizada transferir 10 ml a un
nuevo frasco de dilución, teniendo asi la segunda dilución decimal (10'2), llamada
dilución (B), siendo que 1 ml de la misma corresponde a 0.01 ml de la muestra original.
E1 calculo es el siguiente:
(A) X (B) = dilución final correspondiente
10 X 10
= 1000 = 0.01 ml
100 100
10000
Proceder de esa forma en la secuencia de dilución deseada
(C) (10-3) , (D) (10-4) , etc.
- Ordenar los frascos conteniendo las diluciones,
manteniendo secuencia creciente con relación a los volumenes de la muestra inoculada.
- Agitar fuertemente por ± 25 veces el frasco con la
última dilución efectuada y con una pipeta estéril de 5 ml sembrar 1 ml de la dilución
en cada uno de los tubos de agua peptonada alcalina de concentración simple,
correspondiente a esa dilución.
- Se procede de esta forma sembrando de atras para
adelante, siempre con la misma pipeta de la mayor para la menor dilución.
- Incubar a 35 - 37°C los tubos por 6 - 8 horas. Despues
de la incubación retirar cuidadosamente los tubos de la incubadora, evitando
agitar.
Continuar como en el método cualitativo, hasta las pruebas
de (TSI y LIA). Para las pruebas de oxidasa sacar una pequeña porción del inóculo del
cultivo del agar nutritivo y tocar el papel filtro humedecido con la solución. La
coloración púrpura intensa es considerada prueba positiva.
Para la prueba de string-test; en una placa de vidrio
colocar una gota del desoxicolato y agregar una pequeña porción de la colonia.
Homogenizar con una asa de siembra la suspensión bacteriana y se formará como un hilo,
lo que indica reacción positiva.
Para la prueba serológica, sacar una pequeña porción de
inóculo del cultivo del agar nutritivo y suspenderla en una gota de suero fisiológico
(sobre una placa de vidrio). Paralela a esta suspensión colocar una gota de antisuero
Poly - Vibrio cholerae.
Homogenizar con un asa de siembra la suspensión bacteriana
con el antisuero, haciendo movimiento circular.
Proceder a realizar la lectura, verificando la reacción de
aglutinación. Aglutinación positiva, posible Vibrio cholerae 01.
8. Resultado
El cálculo de la densidad probable Vibrio en una muestra
está basada en la combinación de los resultados positivos y negativos obtenidos en cada
dilución.
Tres diluciones son necesarias para la obtención del
código del NMP.
Se adjuntan los Cuadros 3, 4 y 5.
Figura 4
Preparación de diluciones decimales
9. Bibliografía
American Public Health Association, et al.
Methods for the examination of water and wastewater, 17 edl, New York, APHA 1989
Smith y Canout. Bacteriología de Zineser.
2da. edición en español, 1960
Lloyd, B. The enumeration of Vibrio cholerae
in sewage. Symposium at University of Surrey. Sept. 1976
CETESB. Análisis microbiológico de aguas.
Normalização Técnica Saneamento Ambiental. Sao Paulo, BR 1978
Hammerston, E. & Ljutov, V.
Concentration technique for demonstrating small amounts of bacteria in tap water. Acta
Pathologica et Microbiologica Scandinavica 35, 365-369, 1954.
Vargas de Mayo, Carmen A. Método
simplificado de análisis microbiológico de aguas residuales. Serie Documento Técnico
No. 12 CEPIS/OPS/OMS 1983. Lima, Perú
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