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Aislamiento, Identificación y Cuantificación de Vibrio
Cholerae en Agua Potable, Aguas Superficiales y Residuales

Por: Bióloga Carmen Vargas de Mayo
Abril, 1991


1. Introducción

El Cólera es una enfermedad originaria del Asia, se considera su cuna la región del Delta del Ganges; desde esta zona se difundia por todo el Asia, Africa, atravesando todo Europa y hasta América (2).

Durante el Siglo XIX terribles pandemias azotaron todas las regiones de la tierra, principalmente Asia, Africa y Europa, causando gran mortalidad.

En 1817 , se presenta la epidemia en la India que se extiende en Asia, hasta Pekin y Japón, y por el occidente hasta Astrakan y Costa Africana, epidemia que persistió durante seis años, produciendo grandes estragos sobre todo en la India.

En 1826, se reinicia la epidemia, teniendo una mayor difusión en ciudades como Persia, Moscu, San Petersburgo, Berlin, París y Londres, cruza el Atlantico y llega a Canadá y a Estados Unidos.

En 1864, aparece una nueva pandemia que duró hasta 1875, afectando Asia, Africa, Europa y América.

En enero de 1991 aparece en el Perú, afectando casi simultáneamente a zonas de Chancay, Chimbote, Piura y Callao, difundiéndose posteriormente en casi todos los departamentos del Perú.

Las hipótesis de la aparición del Cólera en el Perú, son las descargas de los barcos que contaminaron el mar, peces, mariscos y a través de portadores sanos, lo cual se vió favorecido por el saneamiento inadecuado, el grado de desnutrición y pobreza de la población en el Perú.

Es conocido que el hombre es el único reservorio del Vibrio y el agua es el principal vehículo de transmisión, de tal manera que el riesgo de contraer la enfermedad es grande, lo que se ve favorecido con el saneamiento inadecuado, ya que las aguas residuales van al rio (para regar las verduras) y al mar.

Siendo el Cólera un problema de salud pública y el hecho de haberse propagado rápidamente no solo en el Perú sino en los países vecinos, es de suma importancia establecer programas de control y vigilancia ambiental.

 2. Definición del Vibrio Cholerae

Se presenta en forma de un bastoncito de 1.5 Am a 2.5 Am de largo y 0.2 - 0.4 Am de ancho, ligeramente encorvado. En ocasiones este encorvamiento es mínimo apareciendo entonces como verdaderos bacilos. También se les denomina bacilos en coma.

El Vibrio cholerae es muy móvil, por un flagelo polar, y es considerado como el más móvil de todas las especies patógenas. Son aerobios o anaerobios facultativos, gram-negativos, fermentan carbohidratos sin producción de gas, no producen hidrógeno sulfurado y son oxidasa, manitol, indol, lisina-descarboxilasa positivos.

Propiedades biológicas

Es un germen relativamente poco resistente a los agentes exteriores, dependiendo su vida de los factores físicos y químicos que influyen sobre él y de los factores biológicos que presentan las otras especies microbianas (2).

En las heces con vibriones, después de 24 horas el número disminuye, sin embargo Greig en la India lo encuentra después de cuatro días en frascos que conserva en la oscuridad.

Pueden permanecer vivos en la tierra dependiendo del grado de humedad y del isolamiento directo que reciba del terreno. En el agua vive largo tiempo, y sólo la existencia de otros microorganismos puede alterar su supervivencia. Se ha comprobado su existencia en aguas de pozo, río y agua de mar.

 3. Método cualitativo

1. Directo

El método consiste en colectar un volúmen determinado de muestra de agua y enviarla al laboratorio en el menor tiempo posible, luego colocar en un medio de cultivo alcalino, de igual volúmen que la muestra y de doble concentración, con pH elevado.

Las muestras son incubadas durante 6 - 8 horas a temperatura de 35 - 37°C ± 0.5 las colonias típicas de TCBS son sometidas a pruebas bioquímicas y serológicas. (6)

 2. Concentración

Existen varias técnicas para el aislamiento a identificación de Vibrio cholerae en aguas. Entre los principales métodos de concentración se tiene: mecha de gasa, método de Moore, tierra de diatomeas y filtro de membrana. El volúmen de muestra está relacionado directamente con el tipo de muestra. (Figura 1)

a) Método de Moore (mecha de gasa) modificado

Instalar la mecha en el lugar de muestreo, de tal manera que permanezca sumergida en el agua durante 48 horas. Después de 48 horas retirar la mecha con mucho cuidado e introducirla en un frasco estéril con tapa y capacidad de 500 ml conteniendo en su interior 300 ml de agua peptonada alcalina de doble concentración. Incubar durante 6 a 8 horas a 35 - 37°C ± 0.5.

b) Concentración con tierra de diatomeas

La técnica de concentración para análisis cualitativo es emplear una capa de tierra de diatomeas, con una almohadilla absorbente de soporte. Volumenes de muestra son concentrados a través de una capa de tierra de diatomeas. El concentrado de los organismos adheridos en la tierra de diatomeas y la almohadilla o pad son colocados asépticamente en un frasco estéril, conteniendo 250 ó 300 ml de agua peptonada alcalina a doble concentración. Incubar durante 6 a 8 horas a 35 -37°C ± 0.5. (6)

4. Método cuantitativo

El método de cuantificación empleará mayor tiempo que el método cualitativo, pero se hace necesario cuando se quiere determinar la densidad de Vibrio en aguas de recreación, en procesos de tratamiento de aguas servidas, aguas superficiales, subterráneas y en aguas de consumo humano.

Dependiendo de la calidad del agua, las muestras son procesadas empleando métodos como NMP, concentración por filtro de membrana y dentro de este último, el de concentracién por tierra de diatomeas.

A. Método del Número Más Probable

Este método estima la densidad de Vibrio empleando tubos múltiples (1). Al emplearse este método se hace necesario conocer con anticipación la densidad probable de Vibrio. 

B. Concentración con tierra de diatomeas

La técnica de concentración para análisis cuantitativo es emplear una capa de tierra de diatomeas, con una almohadilla absorbente de soporte. La finalidad de este método es utilizar el concentrado de los organismos presentes en la muestra (6). Esta tierra de diatomeas es colocada encima de la almohadilla o pad, la que se encuentra sobre la base de la unidad de filtración. De acuerdo al método de Hammerstrom & Ljutov (1954), y M.I. Yaziz & B.J. Lloyd (1978), volúmenes de muestra (Ver Cuadro 2) son concentrados a través de una capa de tierra de diatomeas (3, 5, 7). El concentrado de organismos adheridos en la tierra de diatomeas y la almohadilla o pad son colocados asépticamente en un volúmen de 105.5 ml de medio de enriquecimiento a concentración simple. Este volúmen es distribuido de la siguiente manera: 1 frasco con 50 ml tubos con 10 ml, 5 tubos con 1 ml y 5 tubos con 0.1 ml (Ver Figuras Nos. 1 y 5).

Aplicación

Este método es el adecuado debido a que concentra las bacterias presentes de un volumen de muestra conocida. Por este método es posible filtrar grades volúmenes de muestra sin que llegue a obstruirse (3,5,6).

Cuadro 1

Rango de volumen de muestra de desecho crudo
y aguas superficiales para Vibrio

Método de Tubos Múltiples

 

Tipo de muestra

 

 

 

A. Agua superficial

B. Desecho crudo

 

N° tubos y diluciones empleadas

3           3       3      3        3           3              3
100-   10 -   1 -   0.1 - 0.01 - 0.001 - 0.0001
x          x        x        x        x
            x        x        x        x             x

Cuadro 2

Rango de volumen de muestra de agua de consumo
humano para cuantificación de Vibrio

Método de Tierra de Diatomeas

Tipo de muestra Volumen Concentrado

N°  tubos y volumen de muestra empleada

1 5 5 5
50 ml - 10 ml 1 ml 10
C. Agua
     potable sin
     cloro
2 - 3 1 x x x x
D.Agua
    clorada
4 - 5 1 x x x x

5. Equipos, material y medios de cultivo

1. Equipos y materiales

Estufa para esterilización en seco

Debe estar equipada con un termómetro y un termostato y operar normalmente a temperatura de 160 - 180° C, con suficiente capacidad para permitir la circulación del aire caliente alrededor del material a ser esterilizado.

Autoclave

De tamaño suficiente que permita circular el vapor alrededor del material a ser esterilizado. Debe estar equipado con una válvula de seguridad, termómetro. Debe estar equipado con una válvula de seguridad, termómetro calibrado y colocado en forma tal que se pueda registrar la temperatura mínima del interior de la cámara y un manómetro o medidor de presión.

La temperatura de esterilización debe ser alcanzada máximo en 30 minutos, porque algunos ingredientes de los medios de cultivo, especialmente los que contienen lactosa, no deben ser sometidos al calor durante más de 60 minutos desde que se cierra la tapa del autoclave hasta eu el medio es retirado.

Incubadora de aire caliente

Equipada con un termómetro calibrado con una división de escala de 0.5°C como requisito mínimo. En la incubadora no debe existir variación superior a ± 0.5°C, al mismo tiempo se debe mantener la humedad relativa entre 75 y 85%. Estudios realizados indican que la temperatura ideal para Vibrio cholerae esta entre 35 y 37°C.

La incubadora no debe ser sometida a variaciones existentes de temperatura causadas por fluctuaciones de la temperatura ambiental, cambios de corriente eléctrica o apertura innecesaria.

Potenciómetro

Balanzas

Destilador de agua

Frascos para toma de muestras

De vidrio neutro o plástico autolavable no tóxico, con boca ancha y capacidad suficiente, mínimo un litro.

Placas Petri

Pueden ser de vidrio pyrex, con fondo plano, sin ranuras, de 15 mm de altura por 100 mm de diámetro. Esterilizadas a 160°C durante dos horas en la estufa.

Pipetas

Tipo Mohr de 1 ml, 10 ml, graduadas 1/10, con error de calibración inferior a 2.5%. Pueden ser guardadas en cajas de acero inoxidable, para facilitar la esterilización. Temperatura de esterilización 160°C durante dos horas en la estufa.

Vasos de precipitación

Para la preparación de medios de cultivo. Los vasos pueden ser de vidrio pyrex o de acero inoxidable; libres de cualquier sustancia tóxica.

Tubos de ensayo

De vidrio pyrex o de vidrio neutro de 12 mm x 120 mm, 13 mm x 100 mm. Esterilizados a 160°C por dos horas en la estufa.

Erlenmeyers

De vidrio pyrex o de vidrio neutro, con capacidad de 250 ml y 500 ml. 

Pinzas

Con punta recta y bordes finos.

Asas de inoculación

De platino o niquel-cromo, colocadas en las asas de Koller.

Estuches para placas Petri y pipetas

De acero inoxidable para facilitar la esterilización.

Frascos paraa agua de dilución

De vidrio pyrex, con tapa de rosca, cierre hermético.

Tijeras

De acero inoxidable con punta fina.

Espátulas

Equipo de filtración

De tres o seis vasos.

Vasos de filtración

De 250 6 500 ml de capacidad, resistente al calor.

Bomba de vacio

2. Medios de cultivo y reactivos

Agua peptonada alcalina 

Fórmula

Peptona .............. Cloruro de sodio (NaCl) (NaCl) p.a.
Agua destilada ....... pH final ... 8.6 - 9.0

(Difco 0118-01-8)

 

Concentración

1 X        ó    2 X   1 X       ó    2 X
    10 gr             20 gr
1000 ml      1000 ml
10 gr         20 gr

      5 gr         10 gr
1000 gr     1000 ml

             Preparación

Pesar la peptona y el cloruro de sodio y disolver en 1000 ml de agua destilada fria. Agitar levemente hasta una completa disolución. Ajustar el pH a 8.6 - 9.0 con una solución normal de Hidróxido de sodio (NaOH - 1N). Distribuir en volúmenes requeridos. Esterilizar en autoclave, a 121°C, durante 15 minutos.

Solución normal de Hidróxido de Sodio (NaOH - 1N)

Fórmula

Hidróxido de sodio (NaOH) p.a.    40.0 gr
Agua destilada q.s.p.

Preparación

Pesar 40 gramos de hidróxido de sodio y colocar en un balón volumétrico y completar a un volumen de 1000 ml con agua destilada.

Agas TCBS                                             Difco   0650  -  01  -1

Fórmula

Extracto de levadura .....................................  5.0   gr
Peptona.......................................................... 10.0   gr
Citrato de sodio .............................................10.0   gr
Tiosulfato de sodio (Na2S2O3) p.a.............  10.0   gr
Biles de buey deshidratada .......................    8.0   gr
Sacarosa .....................................................    20.0 gr
Cloruro de sodio .........................................    10.0 gr
Citrato férrico ..............................................        1.0 gr
Azul de Bromotil  ........................................      0.04 gr
Azul de Timol .............................................       0.04 gr
Agar ............................................................      15.0 gr
Agua destilada estéril ...............................   1000 ml
pH final :  8.6

No autoclavear

Preparación

Pesar 89 gramos del medio deshidratado TCBS, Agar y disolver con 1000 ml de agua destilada estéril fría. Disolver agitando frecuentemente y calentando teniendo cuidado de no pasar 92° C. Distribuir en volúmenes de 20 ml aproximadamente en placas de Petri de 100 mm de diámetro, estériles.

Las placas con el medio podrán ser almacenadas en refrigeración (2 - 8° C) en oscuro durante tres días.

Agar hierro-tres azúcares (TSI)

Fórmula

Extracto de carne        ..................................   3,0 gr
Extracto de levadura  ..................................   3.0 gr
Bacto peptona             .................................. 15.0 gr
Proteosa peptona      ..................................     5.0 gr
Dextrosa                       .................................     1.0 gr
Lactosa                        .................................. 10.0 gr
Sacarosa                     .................................   10.0 gr
Sulfato ferroso             ................................      0.2 gr
Cloruro sódico            .................................      5.0 gr
Tiosulfato sódico       .................................      0.3 gr
Bacto agar                  .................................    12.0 gr
Rojo de fenol              .................................       0.024 gr
Agua destilada           ................................       1    1

Preparación

Disolver 65 gramos de los componentes indicados, en un litro de agua destilada o desmineralizada y dejar remojar 15 minutos. A continuación se hierve a vapor fuerte hasta alcanzar su disposición completa. Después de su distribución en tubos de 120 mm/12 mm, a razón de 3-4 ml, se efectua la esterilización en autoclave (15 minutos a 121°C). Luego de la esterilización los tubos se colocan en posición inclinada hasta la solidificación los tuvos se colocan en posición inclinada hasta la solidificación del medio de cultivo.
El pH listo para el uso es de 7.3 + 0.2. El cultivo puro del germen se siembra en la superficie inclinada por frotis, y por picadura en la parte columnar. Se incuba a 37° C por 24 horas.

Agar hierro-lisina (LIA)

Fórmula

Peptona de gelatina                 ............................... 5.0 gr
Extracto de levadura                ............................... 3.0 gr
Dextrosa                                    ..............................   1.0 gr
L-lisina                                       ..............................10.0 gr
Citrato férrico de amonio        ..............................  0.5 gr
Tiosulfato de sodio                  ..............................   0.04 gr
Púrpura de bromo cresol        ..............................  0.02 gr
Agar        ................................................................   13.5 gr
Agua destilada  ...................................................      1  1

Preparación

Disolver 33 gramos de los componentes indicados en un litro de agua destilada. Calentar con agitación frecuente hasta su ebullición. A continuación se distribuye en tubos de 120 mm/12mm con tapa de rosca, a razón de 3-4 ml. La esterilización se efectúa en autoclave (15 minutos a 121°C). Luego de la esterilización los tubos se colocan en posición inclinada hasta la solidificación del medio de cultivo.

El valor del pH listo para su uso es de 6.7 + 0.2. El cultivo puro del germen se siembra en la superficie inclinada, por frotis y por picadura en la parte columnar. Se incuba a 37° C por 24 horas.

Triptona o trípticas (Reacción de indol)

Fórmula

Tiptona o tripticasa ............................................ 10.0 g
Agua destilada         ...........................................    1  1

Preparación

Disolver 10 gramos de triptona o tripticasa en un litro de agua destilada o desmineralizada. Tras su distribución en tubitos de 120 mm/12mm, a razón de 3-4 ml se esteriliza a 121°C (por 15 minutos).

Reactivo de indol según Kovács

Fórmula

Alcohol isoamilico ..................................   75 ml
Acido clorhídrico   ..................................   25 ml
Paradimetilaminobenzaldehido ...............     5.0 gr

Muchos microorganismos pueden escindir triptófano que está presente en abundancia, especialmente en la peptona degradada trípticamente, dando ácido pirúvico, amoniaco e indol. Este último reacciona con el paradimetilaminobenzaldehido produciendo una coloración rojo oscura. Puesto que el triptófano da también una reacción coloreada con el paradimetilaminobenzaldehido, es preciso hacer una separación del indol. Esto se consigue mediante alcohol amílico que extrae selectivamente el indol.

Preparación

Disolver 5 gramos del paradimetilaminobenzaldehido en 75 ml de alcohol isoamílico y adicionar 25 ml de ácido clorhídrico. El reactivo debe ser de color amarillo.

Procedimiento para la prueba de indol

El germen sometido a prueba, cuya pureza de cepa se ha comprobado previamente, se cultiva durante 12 a 24 horas a 37°C en caldo de triptona. Luego se adiciona 0.2-0.3 ml del reactivo de Kovacs y se agita. En presencia de indol libre se presenta al cabo de pocos minutos una coloración rojo cereza en la capa de reactivo.

Prueba de Indol

Preparación de tiras de indol

Fórmula

p-dimethylaminobenzaldehido  .......................   5.0 gr
Methanol ......................................................50.0 gr
0 phosphoric acid  ..........................................10 ml

Preparación

Mezclar los componentes. Guardar en frasco oscuro por tiempo indefinido. Cortar papel filtro en tiras a impregnar con el reactivo, luego secar y guardar en frascos oscuros por tiempo indefinido.

Prueba de Oxidasa

Fórmula

n - n = dimethil - p - phenylenediamine oxalato

Preparación

Diluir pequeñas porciones del reactivo en agua destilada estéril ligeramente tibia, mover ligeramente hasta disolver completamente.

Procedimiento

Impregnar papel filtro con la solución color rosado claro, en el momento de la prueba de oxidación. Con una asa de inoculación retirar una pequena porción de inóculo del cultivo (agar nutritivo), tocar el papel filtro humedecido con la solución.
La coloración púrpura es prueba positiva.

Prueba de String-Test

Solución de desoxicolato de sodio a 0.5%

Desoxicolato de sodio ............................................0.5 gr
Agua destilada .......................................................100 ml

Pesar 0.5 fr de desoxicolato y disolver en 100 ml de agua destilada estéril, guardar en frasco claro.

Procedimiento

En una placa de vidrio colocar una gota del desoxicolate y agregar una pequeña porción de la colonia. Se formará como un hilo.

Solución de Telurito de Potasio

Solución stock a 0.5%

Fórmula

Telurito de potasio (K2Te03) p.a.    ..........................0.5 gr
Agua destilada esteril .............................................100 ml

Preparación

Para 100 ml de agua destilada estéril adicionar 0.5 gr de telurito de potasio y disolver. Colocar en frasco de vidrio con tapa de rosca.

Colocar 1 ml de la solución de stock de telurito de potasio al agua peptonada después de esterilizada y enfriada. (4)

Attar Nutritivo modificado

Extracto de carne    .....................................4.0 gr
Peptona .................................................   10.0gr
Cloruro de sodio  ........................................5.0 gr
Agar    .....................................................15.0 gr
Agua destilada  ......................................1000 ml

pH final luego de esterilización  7.4 - 7.6

Preparación

Pesar los componentes y disolver en un litro de agua destilada fría, dejar en reposo durante unos 15 minutos. Disolver por calentamiento, agitando frecuentemente hasta su disolución total, teniendo cuidado de no llegar a temperatura de ebullición. Distribuir el medio aún estando caliente en volúmenes de 3 a 4 ml en tubos de ensayo de 12 mm x 120 mm. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Retirar del autoclave y aún estando caliente colocar los tubos en posición inclinada hasta que el medio se solidifique.

El cultivo puro del germen se siembra en la superficie inclinada. Se emplea como medio de transporte y cepario de las posibles cepas de Vibrio. (4)

Agua de dilución

Solucion Stock A

Fosfato monopotásico (KH2p04)    ...............................34.0 gr
Agua destilada    .............................................................500 ml

Preparación

Disolver el fosfato monopotásico en 500 ml de agua destilada, ajustar el pH hasta 7.2 con NaOH 1 N y completar el volumen a un litro con agua destilada.

Solución Stock B

Sulfato de magnesio (Mg S047H20)    ..........................50.0 gr
Agua destilada   ...........................................................1000 ml

Preparación

Disolver el sulfato de magnesio en un litro de agua destilada.

Preparación del agua de dilución

Agregar 1.25 ml de la solución Stock A de fosfato monopotásico y 5 ml de la solución Stock B de sulfato de magnesio a un litro de agua destilada.

Distribuir en cantidades que aseguren luego de esterilizar durante 15 minutos a 121°C un volumen de 90 ± 2 ml.

Antisuero - Poly`- Vibrio cholerae

 6. Muestreo

Los puntos de muestreo son ubicados en las posibles vías de entrada del Vibrio cholerae.

En aguas residuales (aeropuertos, puertos, caletas, estaciones de tren, etc.).

Deben ser escogidos lugares próximos a hospitales, red pública, fuentes de aguas superficiales, que reciben aguas residuales domésticas.

Las muestras deben ser debidamente identificadas (número de muestra, fecha y hora de muestreo, lugar de muestreo, origen de la fuente).

Las muestras se podrán obtener en forma directa, colectando una porción o volumen de agua o colocando una mecha (Método de Moore) modificada en el lugar designado y recogerlo despues de 24 6 48 horas.

Para aguas superficiales o aguas residuales se podra colectar volumenes de 100 6 500 ml.

Para la concentración de las muestras se emplea un equipo de filtración Millipore y una capa de 1.5 cm de tierra de diatomeas como capa filtrante, sobre una almohadilla absorbente. (Ver Figura 1) .

Al recolectar la mecha después del tiempo indicado, colocarla en el lugar, en un frasco de boca ancha, que contiene 300 ml de agua peptonada a doble concentración. La muestra deberá ser enviada inmediatamente al laboratorio para el análisis respectivo.

El tiempo recomendado desde la toma de muestra y el inicio del análisis es de dos a seis horas, siendo el tiempo máximo de almacenamiento 24 horas, en refrigeración.

En casos que la muestra no pueda ser analizada en un período de seis horas, se podrá agregar telurito de potasio en concentración 1:200,000 al agua peptonada alcalina.

La finalidad del telurito es inhibir el desarrollo de otras bacterias que puedan interferir el Vibrio.

7. Procedimiento 

Método cualitativo

Para aguas superficiales y aguas residuales se colecta 100 ó 500 ml de muestra y se coloca en medio de cultivo de agua peptonada alcalina de igual volumen que la muestra y a doble concentración.

Para aguas superficiales y aguas residuales, también se emplea la mecha de gasa (modificada) y el método de.concentración con tierra de diatomeas. (Ver Figuras 2 y 3).

La mecha es colocada en agua peptonada alcalina a incubado durante 6 - 8 horas a temperatura de 35 - 37°C.

El concentrado de los organismos adheridos en la tierra de diatomeas y la almohadilla o pad son colocados asépticamente en un frasco estéril o Erlenmeyer conteniendo 250 a 300 ml de agua peptonada alcalina a doble concentración. Incubar durante 6 a 8 horas a 35 - 37°C. Después de la incubación retirar cuidadosamente el frasco de la incubadora, evitando agitar.

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Del agua peptonada, con una asa de inoculación se colecta el material de la superficie, y se siembra en placas duplicadas con medio de selección (TCBS). Las placas con la muestra son incubadas en posición invertida a 35 - 37°C durante 16 - 24 horas.

Después de la incubación se hace el reconocimiento de las colonias típicas desarrolladas en las placas. Las colonias típicas son de 1 a 2 mm de diámetro, amarillas, con halo y ligeramente convexas.

De cada placa de selección se aisla tres colonias típicas de Vibrio y se transfiere a las pruebas bioquímicas. Para las pruebas bioquímicas se emplean tubos de 13 x 100 mm y los medios de cultivo empleados son: triple azúcar hierro agar (TSI), Lisina hierro agar (LIA). La inoculación es por picada en la profundidad y estriamiento en la superficie. Las tiras de papel filtro, para la prueba y de indol, se colocan en los tubos de (TSI). Incubar a 35 - 37°C durante 24 horas.

La lectura de las reacciones bioquímicas de estos medios darán cepas con características de Vibrio, las que pasaran a las pruebas de oxidasa, string test y luego la prueba serológica. La reacción en los tubos de fermentación con los medios de TSI y LIA son los siguientes:

TSI ---------> K/A   (alcalina/ácido, gas a hidrógeno sulfurado negativo)

LIA --------- > K/K  (alcalino/alcalino, no hay cambio de color, gas a hidrÓgeno sulfurado negativo)

INDOL -------> Positivo   (tirAs de papel filtro con color grosella)

Las cepas diagnosticadas bioquÍmicamente y serolÓgicamente como Vibrio son remitidas al Instituto National de Salud, laboratorio de referencia.

MÉtodo cuantitativo

Para las muestras de aguas superficiales o aguas residuales proceder según Cuadros Nos. 1 y 2.

Se puede utilizar series de tres o cinco tubos con agues peptonada, empleando directamente porciones de 100, 10 ml de muestra original; el medio de enriquecimiento debe estar a doble concentración y porciones de 1 ml y menores de 1 ml, el medio de enriquecimiento debe estar a concentración simple. (Ver Figures 3)

Pares la preparacidn de diluciones (Ver Figures 4).

- Con una pipeta est6ril transferir 10 ml de la muestra original a un frasco con 90 ± 2 ml de agua de dilución amortiguada con fosfato. De esta manera se tiene la primera dilución llamada dilución (A) (10-1) correspondiente a 10 ml de la muestra original en el frasco de dilución, siendo que 1 ml de la misma corresponde a 0.1 ml de muestra original.

El cálculo es el siguiente:

                        Volumen de muestra                                                      = dilución (A)
Volumen de agua de dilución + volumen de muestra

Dilución (A)            10          =       10    =   0.1 ml
                       90   +    10            100

-  Homogenizar el frasco que contiene la dilución (A) (10-1) de la muestra y con una nueva pipeta esterilizada transferir 10 ml a un nuevo frasco de dilución, teniendo asi la segunda dilución decimal (10'2), llamada dilución (B), siendo que 1 ml de la misma corresponde a 0.01 ml de la muestra original.

E1 calculo es el siguiente:

(A)  X  (B) = dilución final correspondiente

  10    X    10    =      1000    =  0.01 ml
100        100           10000

Proceder de esa forma en la secuencia de dilución deseada (C) (10-3) , (D) (10-4) , etc.

- Ordenar los frascos conteniendo las diluciones, manteniendo secuencia creciente con relación a los volumenes de la muestra inoculada.

- Agitar fuertemente por ± 25 veces el frasco con la última dilución efectuada y con una pipeta estéril de 5 ml sembrar 1 ml de la dilución en cada uno de los tubos de agua peptonada alcalina de concentración simple, correspondiente a esa dilución.

- Se procede de esta forma sembrando de atras para adelante, siempre con la misma pipeta de la mayor para la menor dilución.

- Incubar a 35 - 37°C los tubos por 6 - 8 horas. Despues de la incubación retirar cuidadosamente los tubos de la incubadora, evitando agitar. 

Continuar como en el método cualitativo, hasta las pruebas de (TSI y LIA). Para las pruebas de oxidasa sacar una pequeña porción del inóculo del cultivo del agar nutritivo y tocar el papel filtro humedecido con la solución. La coloración púrpura intensa es considerada prueba positiva.

Para la prueba de string-test; en una placa de vidrio colocar una gota del desoxicolato y agregar una pequeña porción de la colonia. Homogenizar con una asa de siembra la suspensión bacteriana y se formará como un hilo, lo que indica reacción positiva.

Para la prueba serológica, sacar una pequeña porción de inóculo del cultivo del agar nutritivo y suspenderla en una gota de suero fisiológico (sobre una placa de vidrio). Paralela a esta suspensión colocar una gota de antisuero Poly - Vibrio cholerae.

Homogenizar con un asa de siembra la suspensión bacteriana con el antisuero, haciendo movimiento circular.

Proceder a realizar la lectura, verificando la reacción de aglutinación. Aglutinación positiva, posible Vibrio cholerae 01.

8. Resultado

El cálculo de la densidad probable Vibrio en una muestra está basada en la combinación de los resultados positivos y negativos obtenidos en cada dilución.

Tres diluciones son necesarias para la obtención del código del NMP.

Se adjuntan los Cuadros 3, 4 y 5.

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Figura 4
Preparación de diluciones decimales

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9. Bibliografía

  1. American Public Health Association, et al. Methods for the examination of water and wastewater, 17 edl, New York, APHA 1989

  2. Smith y Canout. Bacteriología de Zineser. 2da. edición en español, 1960

  3. Lloyd, B. The enumeration of Vibrio cholerae in sewage. Symposium at University of Surrey. Sept. 1976

  4. CETESB. Análisis microbiológico de aguas. Normalização Técnica Saneamento Ambiental. Sao Paulo, BR 1978

  5. Hammerston, E. & Ljutov, V. Concentration technique for demonstrating small amounts of bacteria in tap water. Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica 35, 365-369, 1954.

  6. Vargas de Mayo, Carmen A. Método simplificado de análisis microbiológico de aguas residuales. Serie Documento Técnico No. 12 CEPIS/OPS/OMS 1983. Lima, Perú


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